Dès 1866, Charcot donne des « Leçons » à la Salpêtrière, le vendredi, le cours magistral, le mardi soir, la formation clinique, attirant toujours plus d’étudiants. En 1868, il décrit avec son camarade de faculté Alfred Vulpian la sclérose en plaques, qu’il différencie de la maladie de Parkinson, et, l’année suivante, la sclérose latérale amyotrophique, une maladie dégénérative à laquelle son nom restera attaché. Il effectue de nombreux travaux sur les affections de la moelle épinière, la sclérose en plaques, l’atrophie musculaire progressive, la syringomyélie en collaboration avec Alix Joffroy, les atteintes neurologiques de la syphilis ou tabèset celles de l’alcoolisme, la maladie de Basedow en collaboration avec Pierre Marie, la maladie de Menière, les atrophies musculaires progressives et héréditaires. Il produit une clinique d’une finesse inégalée des troubles neurologiques, en particulier les paralysies, les tremblements, les chorées, les vertiges, les épilepsies, et révise les classifications.